Selection and optimisation of nutrient media and conditions for in vitro tissue culture of the lichen Eviernia prunastri (l.) Ach.

Full Text

Актуальность. Проблема загрязнения окружающей среды - одна из глобальных проблем современного мира. Лишайники – особенная группа низших растений, выполняющих функцию очистки воздуха от различных видов загрязнений. Для сохранения природных ресурсов этого вида перспективным является использование метода культивирования лишайника Evernia prunastri (L.) Ach. in vitro, что обусловлено медленным развитием лишайников в природе (1-8 мм в год). С целью достижения оптимальных условий выращивания лишайника использования питательную среду Мурасиге-Скуга [1].

Целью работы является подбор и оптимизация питательных сред и условий культивирования лишайника Еvernia prunastri (L.) Ach. для сохранения и воссоздания природных ресурсов данного вида растений.

Материалы и методы исследования. Материалом служили растения лишайника E. prunastri, собранные в естественных местообитаниях Крымского полуострова. В работе использовались метод культуры тканей in vitro. При культивировании лишайника in vitro использовали стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга, а также модифицированную по составу с добавлением водных или спиртовых вытяжек яблони и вяза. В качестве стерилентов использовали стандартные антисептики с различной экспозицией [1].

Результаты исследования. Как показали проведенные наблюдения за развитием лишайников, культивируемых на жидких минеральных средах в зимне-весеннее время года (февраль - март) при температуре 16 °С, длина светового дня 6-8 часов, первые морфологические изменения эксплантов появляются на 5-8 сутки культивирования. Визуально они проявляются в виде набухания кусочков, эксплантированных на питательные среды. Длительное культивирование (80 суток) на жидких средах не выявило прироста ни микобионта, ни фикобионта. Видимых изменений экспланта не происходило.

Вариант культивирования на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга в зимне-весенний период года три температуре 16°С, длине светового дня 6-8 часов позволил выявить, что аналогично вариантам с жидкими минеральными средами на 5-8 сутки наблюдаются морфологические изменения экспланта. Длительное культивирование (80 суток) не приводило к росту как фито-, так и микобионта.

Культивирование на плотной питательной среде на основе Мурасиге-Скуга с добавлением вытяжек из дуба, яблони, терна показало, что морфологические изменения эксплаптов наблюдались раньше, чем в предыдущих их вариантах, уже на 3 сутки культивирования. На 5-8 сутки наблюдалось появление белых гиф мицелия микобионта, а фикобионт оставался без видимых изменений. [2].

Использование твердых питательных сред с добавкой вытяжек древесных культур (дуб, яблоня, терн) проводилось в весеннее время года (март- май). Дальнейшее выращивание приводило к активному росту микобионта. Видимых изменений фикобионта не наблюдалось. Очевидно, такие условия удовлетворяют потребностям грибного компонента лишайника в углеводном питании и не соответствующей возможности культивирования фикобионта. Условия культивирования при 18 °С, длине светового дня 8-I0 час., совпадающей с весенним периодом, способствует росту микобионта и пассивному состоянию водорослевого компонента, а возможно и угнетению его роста. Сама питательная среда, содержащая углеводы в виде сахарозы или маннита (2 варианта) способствует активному росту мицелия гриба. В естественных условиях в симбиозе поставщиком углеводов для гриба является водоросль. В культуре тканей in vitro симбиотические отношения гриб - водоросль нарушаются, т.к. поставщиком углеводов для микобионта становится питательная среда, а интенсивный рост грибного компонента лишайника подавляет рост фикобионта.

Исследования роста эксплантов на модификациях питательных сред Мурасиге-Скуга с добавлением вытяжек из древесных растений показали, что на среде с добавлением экстракта яблони уже на 5-8 сутки наблюдается рост мицелия гриба, а рост водоросли остается без видимых изменения. На питательных средах с добавлением экстрактов дуба и терна рост микобионта на 2 сутки.

Использование варианта питательных сред с добавлением вытяжек древесных растений проводилось в весеннее время при температуре 18-20°C, что могло оказать неблагоприятное воздействие на рост и развитие.

Вариант культивирования лишайника на питательной среде Мурасиге-Скуга без добавления фитогормонов, с небольшим количеством гибберелловой кислоты (0,5 мг/л), при температуре 13-15°с, длине светового 6-8 часов, соответствующей зимне-весеннему периоду (февраль-апрель), дал ряд положительных результатов. Первые морфологические изменения экспланта наблюдались на 3 сутки культивирования. Заметный рост биомассы лишайника наблюдался на 5-9 сутки за счёт более активного роста микобионта и менее активного роста фикобионта. При этом в развитии водорослевого компонента наблюдался непродолжительный лаг – период (9-12 суток). Такое различие по темпам роста мико- и фикобионта приводит к нарушению симбиотических отношений в искусственных условиях.

Учёт прироста биомассы E. Prunastri проводили путем определения массы сухого вещества в течение 30 суток культивирования. При этом был выявлен ряд закономерностей (рис. 1).

Первоначальная масса экспланта составляла 0,67 мг. Наиболее интенсивный прирост биомассы наблюдался в первые 16 суток культивирования и составлял 74,72 мг. В последующие 10 суток интенсивность прироста снижалась и составляла 5,28 мг. Общий прирост биомассы был равен 60 мг.

В качестве источника углерода в питательных средах использовались сахароза или Д-маннит в количестве 30 г/п. При этом более активный рост наблюдался на среде с сахарозой, чем на среде с Д-маннитом. Прирост биомассы культуры, выращиваемой на среде с маннитом, составляет всего 11,82 мг на 30 сутки культивирования. Можно предположить, что маннит не удовлетворяет полностью обмену веществ гриба.

Кроме учёта прироста биомассы путем определения воздушно-сухого веса, проводилось определение абсолютно сухого веса лишайника, исходного материала и культуры E. Prunastri.

Абсолютно сухой вес экспланта, выращенного на питательной среде, составляет 1,65 мг. После 30 дней культивирования абсолютно сухой вес культуры эвернии сливовой составил 212,5± 1,3 мг. Эверния сливовая при культивировании in vitro увеличивает исходный вес в 122 раза. На тридцатый день выращивания культура E. prunastri достигает максимального веса, после чего прирост биомассы прекращается [3, 4].

В процессе оптимизации питательных сред и условий культивирования in vitro использовались также варианты выращивания в летнее время года при низких положительных температурах порядка 4°С (холодильник). Лишайник культивировали на стандартной питательной среде и модификациях с добавлением водного отвара или спиртового экстракта вяза гладкого. Наблюдение за развитием культуры выявило, что низкие температуры задерживают рост как микобионта, так и фикобионта. Прирост биомассы наблюдался через 80-100 дней культивирования. Исследования показали, что температура оказывает большее влияние на рост лишайника, чем состав питательных сред. Так, низкие температуры (4°с) задерживали рост лишайника на всех трех вариантах питательных сред (стандартная среда, среда с добавлением водного отвары вяза, среда с добавлением спиртового экстракта вяза) [5].

Заключение. В результате проведенных исследований было выявлено, что вариант культивирования Е. prunastri на питательной среде Мурасиге-Скуга при 13-15 °С, слабой освещенности, длине светового дня 6-8 часов, соответствует зимне-весеннему периоду, является лучшим из всех изученных вариантов питательных сред, температурного режима, продолжительности светового дня, освещенности.

Таким образом, в процессе проведения данной работы были установлены закономерности роста и накопления биомассы E. prunastri на нескольких вариантах питательных сред (жидкие, твердые, с добавлением экстрактов древесных культур и минеральные); изучено влияние условий культивирования на развитие лишайника; выявлены особенности симбиотических отношений, заключающихся в различном поведении фико- и микобионта; определена возможность выращивания лишайника в культуре тканей in vitro.

About the authors

Anife Renatovna Suleymanova

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: a.suleymanova017@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-6962-6372
Russian Federation, 295007, Republic of Crimea, Simferopol, Prospekt Vernadskogo, 4

Eleonora Pavlovna Kiriakidi

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Author for correspondence.
Email: kiriakidi98@list.ru
ORCID iD: 0009-0000-3222-9481

Lecturer of the Medical College of the Order of the Red Banner of Labour of the S.I. Georgievsky Medical Institute of the V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Russian Federation, 295007, Republic of Crimea, Simferopol, Prospekt Vernadskogo, 4

Elena Alexandrovna Egorova

V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: egorovapharm@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4012-2523

Candidate of Pharmaceutical Sciences, Assistant Professor, Department of Basic and Clinical Pharmacology, Order of the Red Banner of Labour, S.I. Georgievsky Medical Institute of the V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Russian Federation, 295007, Republic of Crimea, Simferopol, Prospekt Vernadskogo, 4

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.